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    染色

    時間:2020-09-27 17:08

    點擊數:404

    一、染色的作用

    染色的作用是為了提高標本各部分在光學顯微鏡下的分辨率。

    未經染色的組織切片和細胞涂片不能直接在光學顯微鏡下觀察。即使是顯微鏡有足夠的分辨率和合適

    的放大倍數,還必須要求標本各部分結構對光的折射率有較顯著的差別,方能加以辨認。

    二、生物染料

    染料從來源上可分為天然染料(如蘇木精、卡紅、巴西木精)和人工合成染料;從化學組成上可分為

    無機染料和有機染料。我們常用的染料主要是人工合成的煤焦油染料,它主要是含主香碳環和雜環的

    有機化合物。這些有機化合物必須自身具有顏色,同時與被染物質分子間有一定的親和力方能稱為染

    料。我們知道,染料的顏色和與被染物分子間的親和力是由染料的分子結構決定的。在染料分子中有

    使其產生顏色的發色團和使染料顏色加深的并與被染物質間產生親和力的助色團。

    (一)發色團

    使有機分子產生顏色的含有不飽和鍵的基團稱為發色團也稱生色團。將發色團引入分子之后可使有機

    化合物選擇性吸收光譜向長波長移動,即從肉眼不可見的紫外光區移向可見光區,從而使分子顯色。

    有機分子中引入發色團有可能使有機化合物顯色,但在有機分子中僅僅有發色團并不一定就顯示顏

    色,還要看發色團被引入有機分子后,是否使有機分子形成較大的共軛體系,共軛程度越大顏色越

    深。有顏色的有機分子必需引入助色團,才能與被染物分子產生親和力,使被染物著色,因此把有發

    色團又有助色團的有機化合物稱為染料。

    (二)助色團

    能夠使染料分子顏色加深,極性加大,并與被染物質分子間形成親和力的基團稱為助色團。使染料分

    子與被染物質分子間產生親和力是助色團最主要的作用。助色團使染料分子色度加深、染料分子極性

    增強,易離子化。

    助色團多為極性基因,有的還具有酸堿性,如?OH與苯環相連有弱酸性,?NH2及其取代物具有堿性,?

    SO3H具有強酸性,?COOH具有弱酸性,這些基因引入有機分子之后不僅增強其極性而且與堿或酸成

    鹽,易溶于水并電離成正負離子,促進染料與被染物分子間的結合。

    三、染料的分類

    1、天然染料

    2、合成染料(又稱煤焦油染料)

    合成染料都是從煤焦油中提取苯的衍生物。它還可以按其分子中所含的發色團現分為九大類(或十大

    類)。

    (1)亞硝基染料類

    發色團為亞硝基(?NO),如萘酚綠?B

    (2)硝基染料類

    發色團為硝基(?NO2),如苦味酸,萘酚黃?S,馬汀黃。

    (3)偶氮染料

    發色團為偶氮基(?N=N?)。這一類染色劑很多。常用的有偶氮紅,剛果紅,偶氮焰紅,麗春紅,俾

    士麥棕,橙黃-G,蘇丹I-Ⅳ,蘇丹黑-B,油紅-O等。

    (4)重氮鹽類

    (5)醌亞胺染料

    這類染料分子中含有兩個發色團,一個是亞胺基及一個醌基常用的有:中性紅,美藍,,尼羅藍、天

    青石藍甲苯胺藍,硫堇、亞甲綠、萘酚藍、沙黃、亞甲紫、天青、焦油紫等。

    (6)苯甲烷類染料

    發色團為醌基,分子結構中一個碳原子上連有兩個苯基和一個醌基。

    常用的有:堿性品紅,酸性品紅,苯胺蘭,二甲苯藍,依思明藍,亮綠,碘綠,黃色淺綠?SF,孔雀

    綠,甲基綠,結晶紫、霍夫曼紫、乙基紫,尤膽紫(無水結晶)、甲基紫等,如:孔雀綠的結構。

    (7) 叮類染料

    發色團為醌基。

    (8)蒽醌染料

    發色團為醌基。

    (9)噻唑類染料

    發色團為胺基,偶氮基等。

    (10)喹啉類染料

    發色團為醌型結構喹啉環。常用的喹啉類染料為花青素(喹啉藍)。

    3、無機化合物

    除了天然染色劑和合成染色劑之外,在生物染色中還使用一些無機化合物,如氯化金、硝酸銀、碘、

    高錳酸鉀等。

    (二)根據染料的化學反應分類

    因為助色團有酸性助色團和堿性助色團之分,故染料也就相應地有酸性染料和堿性染料之別。

    1、酸性染料

    酸性染料不是指其水溶液一定顯酸性。而是指含有酸性助色團與堿作用成鹽,其水溶液電離出的有色

    離子為陰離子染料為酸性染料。酸性染料是一類色酸鹽,含有酸性助色團,常與堿作用生成鈉鹽、鉀

    鹽、鈣鹽或銨鹽,一般溶于水和乙醇。多作為胞漿染色劑。常用的有伊紅、酸性品紅、苦味酸、剛果

    紅、甲基藍、水溶性苯胺蘭、堅牢綠-FC和橙黃-G等。

    2、堿性染料

    是一類色堿。含有堿協助色團,其水溶液不一定顯堿性,而是與酸能成鹽,如與硫酸、鹽酸成鹽,電

    離后有色離子為陽離子,這類染料一般能溶于水和乙醇。多作為胞核染色劑。常用的有蘇木紅(天然

    染料)、美藍、中性紅、甲基綠、孔雀綠、甲苯胺藍、尼羅藍、沙黃等。

    四、染色的物理作用和化學作用

    染料和被染物結合而著色的過程是相當復雜的。如染料與被染物之間的相互作用,染料與助染劑之

    間,染料與溶劑之間,被染物與溶劑之間,都存在一定的相互作用和影響。在染色過程中染料與被染

    物之間既存在物理作用,又存在化學作用,是二者合作用的結果。

    (一)物理作用

    染色的物理作用包括毛細現象,吸附作用和吸收作用。

    1、毛細現象

    毛細現象又叫毛細管作用。含有細微縫隙的物體與液體相接觸時,液體靠表面張力沿細微縫隙上升或

    擴散的現象叫毛細現象??p隙越細毛細現象越顯著。內徑小到足夠引起毛細現象的管子叫毛細管。組

    織有許多的微孔,就可借助毛細管作用與染料接觸,這是純粹的物理作用,相當于混合,結合得不

    牢,不能稱為染色,但染色過程它是第一步。

    2、吸附作用

    吸附是指物質在相界面上濃度自動發生變化的過程,是一種物質從它的周圍把另一種物質的分子、原

    子、離子集中在界面上的過程叫吸附作用。具有吸附作用的物質叫吸附劑,被吸附的物質叫吸附質或

    吸附物。吸附作用又分物理吸附和化學吸附。

    物理吸附是由于范德華力引起的,作用力弱、吸附為多分子層、無選擇性。吸附熱小,吸附速度快。

    化學吸附是由于形成化學鍵的結果。作用力強,是單分子層吸附、有選擇性、吸附熱大、吸附速度

    慢。在低溫下進行的吸附一般都是物理吸附?;瘜W吸附常在較高的溫度下進行。

    3、吸收作用

    吸附質如果進入了吸附劑的內部并均勻地分布在其中,這種現象又稱為吸收。

    4、分子間的作用力

    分子間的作用力是由范德華(Van der walls)第一個提出的,所以把這種力叫范德華力。

    (二)化學作用

    組織和細胞內化學物質的分子內含有酸性、堿性和兩性基團。在一定條件下,被染物質的分子以這些

    基團與染料分子的助色團發生化學結合而染色。結合方式:離子鍵,共價鍵和氫鍵。

    五、細胞的染色

    (一)細胞核的染色

    細胞核的主要化學成分是核酸和蛋白質。

    蛋白質分子中的氨基酸殘基含有酸性基團或堿性基團,它可以與染料分子以離子鍵,氫鍵或配價鍵結

    合。蛋白質的兩性電離受環境的pH值影響。核酸包括DNA和RNA。核酸是由單核苷酸連接成的大分子。

    在DNA雙螺旋結構中,兩條核酸鏈上的磷酸基向外,并電離為負離子使DNA雙螺旋的外側帶負電荷。因

    此容易和帶正電荷的堿性染料以及媒染染料以離子鍵或氫鍵相結合。染色體的主要成分為呈酸性的

    DNA、和RNA,在染色體環境(pH為7.5-7.8),呈酸式電離,帶負電,易被電離后帶正電荷的堿性染

    料染色。核質的主要成分為堿性蛋白質,電離后帶正電荷,易被負電荷的酸性染料染色。而核仁具有

    酸堿兩性的性質。

    (二)胞漿染色

    胞漿的主要化學成分是蛋白質,其次是RNA和脂蛋白質等,多為兩性化合物。胞漿的等電點大約在

    pH4.7-5.0。胞漿的染色與pH值密切相關。當pH值在3.6-4.7之間,恰好胞核帶負電荷為堿性染料染

    色,胞漿帶正電荷為酸性染料染色,使胞核和胞漿區分開來。

    (三)胞膜的染色

    細胞膜的主要成分為類脂和蛋白質,形成流動鑲嵌脂質雙層結構。膜的外表面分布有糖脂、磷脂和蛋

    白質,帶負電荷,易被堿性染料染色。

    六、媒染染料的染色

    (一)媒染染料

    有些染料直接對組織染色時,由于染料與組織間的作用力很弱,有時甚至無作用,因此組織著色很

    淺,甚至不著色。我們必須將這類染料先與媒染劑(如金屬離子)結合,生成色淀再對組織進行染

    色。凡是能與媒染劑(如金屬離子)結合生成色淀的染料稱為媒染染料。

    常見的媒染染料多半是天然染料,如蘇木精,卡紅等。

    人工合成的煤焦油染料一般不需媒染劑,但有時媒染劑可加強其染色效果,提高染色的堅牢度。

    (二)媒染劑

    凡能和組織及染料結合,生成色淀,并促進染色的金屬離子鹽類或金屬原子的含氧酸等稱為媒染劑。

    媒染劑既能和染料結合,又能和組織結合,在組織與染料之間起到一個媒介的作用。

    常用的媒染劑多為過渡金屬元素,一至三價的可溶性鹽類或氫氧化物,如鋁鹽、鐵鹽、明礬及金屬含

    氧酸等。

    (三)促染劑

    促染劑是指只增強染料的染色能力,但不參與染色反應的一類物質。如美藍染液中的氫氧化鉀,伊紅

    染液中的冰醋酸、洋紅染液中的硼砂、硫堇染液中的石炭酸,金屬浸潤法中常用的巴比妥及佛羅那

    等。促染劑的作用是增強染料的染色能力,它與媒染劑的區別在于它不參加染色反應。

    七、蘇木精-伊紅染色方法

    蘇木精(hematoxylin)和伊紅(eosin)染色方法,簡稱HE染色方法,是細胞與組織學最廣泛的染色

    方法。

    一、HE染色的基本原理

    (一)細胞核染色的原理

    細胞核內的染色質主要是去氧核糖核酸(DNA),DNA的雙螺旋結構中,兩邊鏈上的磷酸基向外,帶負

    電荷,呈酸性,很容易與帶正電荷的蘇木精鹼性染料以離子鍵或氫鍵結合而被染色。蘇木精在堿性溶

    液中呈藍色,所以細胞核被染成藍色。

    (二)細胞漿染色的原理

    細胞漿內主要成分是蛋白質,為兩性化合物、細胞漿的染色與pH值有密切關系,當pH調到蛋白質等電

    點4.7-5.0時,胞漿對外不顯電性,此時酸或堿性染料不易染色。當pH調到6.7-6.8時,大于蛋白質的

    等電點pH值,表現酸性電離,而帶負電荷的陰離子,可被帶正電荷的染料染染色,同時胞核也被染

    色,核和胞漿難以區分。因此必須把pH調至胞漿等電點以下,在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷(陽

    離子),就可被帶負電荷(陰離子)的染料染色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料,在水中離解成

    帶負電荷的陰離子,與蛋白質的氨基正電荷(陽離子)結合而使細胞漿染色,細胞漿、紅細胞、肌

    肉、結締組織,嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色,與藍色的細胞核形成鮮明的對比。

    (三)、二甲苯的作用

    烤片后切片進入二甲苯是脫蠟的作用。組織處理和染色后進入二甲苯是透明作用。組織處理的透明是

    為了石蠟能進入到細胞中去,染色后透明是為了使細胞的折光率與玻璃相同,以便顯微鏡觀察。

    (四)、酒精的作用

    酒精用于蘇木精染色前由高濃度至低濃度是為了洗脫用于脫蠟的二甲苯。

    伊紅染色以后的酒精由低濃度至高濃度酒精逐漸過度是為了徹底脫去組織中的水份。

    (五)、水洗的作用

    在脫蠟經酒精處理之后,水洗切片,是為了蘇木精染液能更好的進入細胞核中去,使細胞核染色均

    勻。

    染色之后的水洗作用是為洗去未與切片結合的染液。

    分化以后的水洗則是為了除去分化液和脫下的染料,中止分化作用。

    在伊紅染色之后也可以水洗,是為了減少伊紅染液進入脫水的酒精中。

    (六)分化和藍化作用

    1、分化作用

    蘇木精染色之后,先用水洗去未結合在切片中的染液。然后用分化液1%鹽酸酒精脫去細胞核中結合過

    多的染料和細胞漿中吸附的染料,這個過程稱為染色的分化作用。

    2、藍化作用

    分化之后蘇木精在酸性條件下處于紅色離子狀態,在堿性條件下則處于藍色離子狀態,而呈藍色。所

    以分化之后用水洗除去酸而中止分化再用溫水或弱堿性水使染上蘇木精的細胞核變藍色,稱藍化作

    用,以自來水浸洗或溫水變藍為佳。

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