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    制片技術

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    病理切片制作技術的基本方法

    時間:2019-04-08 09:27

    點擊數:999

    【實驗原理】
    采用光學顯微鏡研究一般生物體的內部結構,在自然狀態下是無法觀察清楚的,多數動、植物材料都必須經過某種處理,將組織分離成單個細胞或薄片,光線才能通過細胞。為了適應這個需要,就產生了光學顯微鏡制片技術。
    光學顯微鏡的制片技術方法可分為兩大類:一類是非切片法,另一類是切片法。
    非切片法,是用物理或化學的方法,使細胞彼此分離,如有分離法、涂布法、壓碎法等。非切片法的操作比較簡單,能保侍細胞的完整,但是細胞之間的正常位置往往被更動,無法反映細胞之間的正常聯系。它可以與切片法配合使用,各取其長處。
    切片法,是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層,材料須經過一系列特殊的處理,如固定、脫水、包埋、切片、染色等,過程十分繁復。在制作過程中,還要經過一系列的物理和化學的處理,這些處理方法可根據各種不同材料的性質要求進行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣,技術復雜,但是,它最能保持細胞間的正常的相互關系,能較好和較長時間地保留細胞的原貌,所以仍然是光學顯微鏡的主要制片方法。

    【方法與步驟】
    光學顯微鏡切片制作技術最簡單的切片法是徒手切片,但是由于組織塊往往十分柔軟,
    切削很困難,而且無法得到十分菲薄的切片,因此必須先用某些特殊物質滲入組織塊的內部起支持作用,并將整個組織塊包住,然后再用精密的切片機制作切片,才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法,包埋的物質稱為包埋劑。分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等,它們各有長處,可以根據需要選用,但是使用得最多的還是石蠟切片技術。
    石蠟作為包埋劑,有其獨特的優點,例如:石蠟能切出極薄的蠟片(210μm);切片時能連成蠟帶,便于制作連續切片;操作較容易,組織塊可以包埋在石蠟中長期保存。然而石蠟切片的制作過程較長,步驟很多,一步不慎往往導致前功盡棄,而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮,切片時受濕度影響比較大,這些不足之處必須在制片過程中認真對待,盡量減小它的不良影響。
    石蠟切片的制作過程主要包括:取材,固定,脫水,透明,透蠟,包埋,切片,貼片,染色,透明,封藏等步驟。
    1.取材
    材料的好壞直接影響到切片的質量,以下幾點是必須注意的。
    取材必須新鮮,這一點對于從事細胞生物學研究尤為重要,應該盡可能割取生活著的組織塊,并隨即投入固定液。切取材料時刀要銳利,避免因擠壓細胞使其受到損傷。切取的材料應該小而薄,便于固定劑迅速滲入內部。一般厚度不超過2mm,大小不超過5×5mm2。
    2.固定
    組織和細胞離開機體后,在一定時間內仍然延續著生命活動,會引起病理變化直至歸于死亡。為了使標本能反映它生前的正常狀態,必須盡早地用某些化學藥品迅速地殺死組織和細胞,阻抑上述變化,并將結構成分轉化為不溶性物質,防止某些結構的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外,固定劑會使組織適當硬化以便于隨后的處理,還會改變細胞內部的折射系數并使某些部分易于染色。
    固定劑的作用對象主要是蛋白質,至于其他成分如脂肪和糖,在一般制作時不加考慮,如要觀察這些物質,可用特殊的方法將其固定下來。
    固定劑的作用表現在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小,都依所固定的材料性質而定,同樣一種固定液對某一材料來說是良好的,但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特征是:穿透組織的速度快。,能將細胞中的內含物凝固成不溶解物質,不使組織膨脹或收縮以保持原形,硬化組織的程度適中,增加細胞內含物的折光度,增加媒染和染色能力,具有保存劑作用。 固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。
    簡單固定劑即單一的固定劑,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中,苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白,又能凝固核蛋白;乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白;甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質都不凝固。
    簡單固定劑的局限性較大,如將其適當混合,制成復合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有:
    Bouin液(70份苦味酸飽和水溶液+254%甲醛+5份冰醋酸)、Zenker液(升汞5g+重鉻酸鉀2.5g+硫酸鈉1.0g5ml冰醋酸+100ml蒸鎦水)、Carnoy改良液(3份無水乙醇+1份冰醋酸)等。固定劑的種類甚多,我們必須依據各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。

    19
    固定時,須注意以下幾點:
    1)固定劑應有足夠的量,一般為組織塊體積的1015倍。
    2)如所固定的材料外表有不易穿透的物質,可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘,再移入水溶性的固定液。
    3)材料固定后如不立即下沉,可將其中氣泡抽出。
    4)固定時間依材料大小、固定劑種類而異,可從1小時到幾十小時,有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強,作用時間應嚴加控制,不能過長。
    5)一般固定劑都以新配制的為好,用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者,一定要在使用前才混合。
    6)固定完畢,根據所用固定劑的不同,用水或乙醇沖掉殘留的固定劑,以免固定劑形成沉淀,影響以后組織塊的染色。
    3.脫水
    生物組織中含有大量的水分,它和石蠟是不能相溶的,致使在包埋時石蠟無法滲入組織內部,因此須使用脫水劑將水分除盡,這就是脫水的作用。
    脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類:一類是非石蠟溶劑,如乙醇、丙酮等,脫水后必須再經過透明,才能透蠟包埋;另一類是兼石蠟溶劑,如正丁醇,脫水后即可直接透蠟。
    常用的脫水劑是乙醇,因為它價格便宜,易于得到。為了避免劇烈的擴散引起的組織的強烈收縮,脫水步驟應從低到高以一定的濃度梯度來進行,一般組織從30%乙醇開始,經過50%、70%、80%、95%、100%至完全脫水;對于一些柔軟的組織應從15%開始。脫水時間依據組織的類型和大小而定,一般各級乙醇中放置45min1h,如果中間須停頓,應使材料停留在70%乙醇中,因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體,高濃度乙醇有脆化組織作用,放置時間不能過長,另外,脫水必須在有蓋瓶中進行,以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中,如需長期保存,可加入等量的甘油。
    丙酮也是很好的脫水劑,其作用和用法與乙醇相同,不過其脫水力和收縮力都比乙醇強。
    甘油常用于藻類、菌類及柔弱材料的脫水。
    六環為無色的石蠟溶劑,對組織沒有收縮及硬化等不良后果,但其蒸氣有毒,使用時須小心。
    正丁醇可與水及乙醇混合,亦為石蠟溶劑,其優點是很少引起組織塊的收縮與變脆。
    叔丁醇的性質、作用和用法同于正丁醇,但因其價格昂貴而很少使用。
    4.透明
    組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經過透明。透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合,它取代了脫水劑后,石蠟便能順利地滲入組織。
    透明劑的種類很多,較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。
    二甲苯作用較快,透明力強,但組織塊在其中停留過久,容易收縮變脆變硬,同時若脫水不凈,就會引起不良后果,在應用時必須特別小心。通常將組織塊先經純乙醇與二甲苯的等體積混合液,再進入純二甲苯,這樣可減少上述的缺點。透明時間應由組織大小而定,般各級停留時間在30min2h,在純二甲苯中應更換2次,總時間則以不超過3h為宜。材料經過透明,會顯示出前一步脫水的效果如何,若脫水徹底,組織則顯現透明狀態,如組織中有白色云霧狀,說明脫水不凈,須返工處理,但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時,應避免其揮發和吸收空氣中的水分,并保持其無水狀態。 20
    甲苯的一般性質與二甲苯相似。用法亦同,唯沸點較低,透明較慢,但不會使組織變脆。
    苯的用法同于二甲苯,對組織的收縮作用小,但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適于大塊組織的透明。
    5.透蠟和包埋
    包埋用的石蠟,熔點在5060之間,應根據材料本身的硬度、切片的厚薄和當時的氣溫條件來選用。一般動物材料最常用的石蠟熔點為5256,植物材料的用5458的;切片薄的用5860的,切片厚的則用5254的;室溫1019時選用5254的石蠟可順利切片,冬季可用熔點4648的石蠟,夏季可選5658的。
    石蠟的優劣與切片的成敗密切相關。鑒別石蠟質量的方法是:將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結且無氣泡和裂痕,3035放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點出現,蠟塊裂面不呈顆粒狀,切成薄片不碎成細粒。這種石蠟即為品質優良。含有雜質的新蠟或用過的廢蠟可清潔后再用,方法是將石蠟放入鍋內,加熱到開始冒白煙,然后用小火繼續加熱30min(注意別超過發火點),使其去除水分和揮發性雜質,并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。
    透蠟須在恒溫箱中進行,恒溫箱的溫度調節至高于石蠟熔點3度,使經過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應處理23次,透蠟的時間依材料性質而定,一般每次需1530min。
    透明的關鍵是控制溫度的恒定,切忌忽高忽低,溫度過低石蠟凝固無法滲透,溫度過高使組織收縮發脆。
    包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是;先準備好紙盒(具體折法見圖1-3及說明),將熔蠟倒入盒內,迅速用預溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部,切面朝下,再輕輕提起紙盒,平放在冷水中,待表面石蠟凝固后立即將紙盒按入水中,使其迅速冷卻凝固,30min后取出。
    包埋用蠟的溫度應略高于透蠟溫度,保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要,否則包埋塊中將會產生結晶。以后切片時引起碎裂。
    6.切片
    1)石蠟塊的固著與整修
    在包埋以后,就可進行切片。包埋好的石蠟塊裝上泰維生物組織切片機進行切片前還須進行固著和整修。
    固著:一般旋轉式切片機上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤,這也可用同樣大小的臺木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上,并使組織塊朝外,便于以后迅速切出所需的片子。
    整修:用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平,使上下兩面修成平行面,常保留組織周圍附著寬23mm的石蠟,而修好的蠟塊呈長方形。還可削去一角以便于在蠟帶上識別切片。
    2)切片機和切片刀
    切片機是用來作各種組織切片的一種專門設計的精密機械,常用的是旋轉式切片機,它的夾物部分是上下移動前后推進的,而夾刀部分則固定不動。主要部件是安裝切片刀的刀臺、安裝包埋塊的標本臺和控制切片厚度的微動裝置。切片時切片刀固定不動,轉動轉輪,標本臺上下運動并按調好的切片厚度向前推進一定的距離,組織塊上下運動一次,便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。
    切片刀與切片的質量直接相關。切片前必須磨刀,方法是:將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上,將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨,使用完畢后應及時用二甲苯將石蠟油擦凈。
    3)切片方法
    切片前,將刀口置放大鏡下觀察,選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削。將所要切的包埋塊固定在標本臺上,使包埋塊外切面與標本夾截面平行,并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣后松開刀片夾的螺旋,上好刀片,使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角,包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調節切片要求的厚度,調節時應注意指針不可在兩個刻度之間,否則容易損傷切片機,將刀臺移至近標本臺處,讓刀口與組織切面稍稍接觸,這時就可以開始切片了。方法是:右手轉動轉輪,左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子,并托住切下的蠟帶,待蠟帶形成一定長度后,右手停止轉動,持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起,平放于襯有黑紙的紙盒內,注意切片速度不宜太快,搖動轉輪用力應均勻,防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻,還應注意轉動的方向,以防標本臺后移而切不到片子。切片完畢,應及時用氯仿將切片機的有關部分擦凈。
    4)切片中存在的問題及補救方法
    石蠟切片是很不容易掌握的,有時很容易成功,有時則由于某種因素而造成切片的質量低劣,甚至完全失敗?,F將切片時經常遇到的一些缺點、可能的原因以及補救辦法列于表1-3。



    7.貼片
    切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進一步處理,但是切片常有細小的橫紋,必須經展平后才能貼附,否則影響染色和觀察。
    貼片一般有撈片法和燙板法。
    撈片法比較簡單,首先將切片分割開,投入到48的溫水浴中,這時切片都浮在水面上,由于表面張力的作用使切片自然展平,然后用涂有甘油蛋白溶液(將雞蛋一個打破入杯中,去除蛋黃留下蛋白,用筷子充分調打成雪花狀泡沫,然后用雙層紗布過濾至容器中,加入等量的甘油,混合,最后加入百分之一體積的麝香草酚(thymol)作防腐用,可保存幾個月到一年。)或5%明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片,使切片貼附在載玻片的合適位置,于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥。
    燙板法,是將涂有粘片劑的載玻片上涂上水,把已分割好的切片貼上去,再置載玻片于35恒定的燙板上讓切片攤干,并傾斜或用吸水紙吸去水分,最后將載玻片再度放燙板上晾干。
    要注意,不管是使用撈片法還是燙板法,所用的載玻片必須潔凈,不能有油污(檢驗法:已涂有粘片劑的載玻片上滴加數滴蒸餾水,若發現水不均勻分散而聚成滴狀,即表示載玻片不清潔,有殘留油脂等物在上面);切片的光面應朝下,否則染色過程中切片容易脫落。
    8.染色
    組織切片是無色透明的,必須進行染色后才能觀察到各種微細結構。染色方法很多,但是染色劑往往是水溶液,因此切片必須經過脫蠟而再度復水。這方法即為脫水、透明的逆過程。由于切片十分菲薄,處理的時間大大減少,一般每級停留約25min。
    染色是一個復雜的過程,兼有物理和化學作用,對其中的機制目前了解得不很清楚。研究細胞器和細胞內的重要組分都有很多現成的方法,例如顯示DNAFeulgen反應,顯示RNABrachet反應,顯示多糖的PAS反應,顯示蛋白質的Millon反應和顯示某些酶的鈣鈷法等,可以根據不同的要求來選用。
    9.透明
    染色后的切片須再次經過脫水、透明。標本經二甲苯透明后,折射率改變,透明度提高,使得染上色的部位更清晰地顯示出來。
    10.封藏
    封藏的目的是使制成的切片能夠永久保存,封藏劑必須能與透明劑互溶,對染色無影響,折射率近似玻璃和具有粘性的物質,常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。
    封片的方法是:將載玻片從二甲苯中吸出后,吸去多余的二甲苯,在標本上的二甲苯尚未干透之前加一滴樹膠,仔細覆蓋上蓋玻片,避免產生氣泡,也不得拖動蓋玻片,以免將標本破壞。樹膠量視蓋玻片大小而定,勿使過多過少。
    貼上標簽,注明材料、染色法,待封藏劑凝固后便成為一張成功的石蠟切片。

     

     

     

     

    石蠟切片基本步驟之一 器材和試劑

    一、準備工作(一)
    (一)洗滌實驗所需器皿:(玻璃器皿的清洗)
    1、 用洗衣粉將玻璃器皿表里擦洗干凈反復洗刷
    2、 將器皿在自來水下沖洗干凈
    3、 將器皿倒扣在鋪有吸水紙或紗布的桌子上控干
    注:一般情況下,經以上步驟后,用蒸餾水洗過1~3次即可烘干備用,如果做特殊染色還需浸泡在酸性清潔液內12~24小時,再經自來水徹底沖洗,再用蒸餾水過洗1~3次 烘干備用。
    (二)配制: 硫酸洗液的配制
    (三)載玻片與蓋玻片的處理
    1. 將所需載玻片與蓋玻片清洗后,放入硫酸重鉻酸鉀溶液中浸泡24小時
    2. 流水沖洗,再用蒸餾水沖洗3
    3. 95%~100%酒精浸泡24小時,用綢布擦干備用
    注:在將載玻片與蓋玻片放入清潔液中時,要一片片地投入,使其不致重疊。
    二、準備工作(二)常用液體的配制
    (一)緩沖溶液:
    1.磷酸鹽緩沖液
    A液:0.1mol/L磷酸二氫鈉
    B液:0.1mol/L磷酸氫二鈉
    A液與B液按比例混合調整到所需的PH值(37≈PH7.0
    2.枸椽酸緩沖溶液
    A液:0.1mol/L枸椽酸
    B液:0.1mol/L枸椽酸鈉
    A液與B液按比例混合調整到所需的PH值(6.242.8≈PH6.2
    (二)固定劑:
    1.甲醛:10%甲醛
    福爾馬林 100ml
    蒸餾水 900ml
    注:實際甲醛含量只有3.6~4.0%但習慣上都將其視為10%。
    210%中性福爾馬林鈣固定液
    甲醛液 10ml
    蒸餾水 90ml
    加碳酸鈣至過飽和(以容器底部碳酸鈣沉淀1~2cm厚為適度)充分振蕩混合后,放置24小時取上清液使用。
    34%多聚甲醛:
    8%多聚甲醛
    多聚甲醛 8g
    蒸餾水 100ml
    加溫至60左右,不時攪拌,成為乳白色溶液。滴加1N NaOH,并不停攪動至液體清明。
    1N NaOH
    lN等于1L溶液中某種物質1mol除以該物質的氫當量價所得數值的量
    氧化鈉(NaOH );分子量=40005,當量價=1
    1N Na0H的配制方法為:m40005140005g。取40005gNaOH溶解于1L蒸餾水中
    4%多聚甲醛
    8%多聚甲醛 50ml
    0.1M磷酸鹽緩沖液 50ml
    PH7.2
    先取50 ml 8%多聚甲醛,用0.1M磷酸二氫鈉和0.1M磷酸氫二鈉將PH值調至7.2
    4Bouin液:
    苦味酸飽和水溶液 75ml
    36~40%福爾馬林液 25ml
    冰醋酸 5m1
    5.改良Bouin氏固定液
    苦味酸飽和水溶液 45ml
    95%酒精 45ml
    36~40%福爾馬林液 5ml
    冰醋酸 5m1
    6Carnoy液:
    冰醋酸 10 m1
    氯仿 30 m1
    無水乙醇 60 m1
    以上三者臨用前混合,預冷至4后使用。24小時后固定液失效。
    (三)染色液
    1Harris蘇木精液
    A液:
    蘇木精 1g
    無水酒精 10ml
    B液:
    銨礬或鉀礬 20g
    蒸餾水 200ml
    氧化汞 0.5ml
    冰醋酸 8ml
    將礬溶于水,加熱溶解(B液),稍冷后將蘇木精酒精液(A液)混入B液,加熱,稍冷卻,加氧化汞,再繼續加熱1分鐘,染液變為紫色,注意在加氧化汞時宜逐漸少量加入,防止染液濺出。全冷后呈深紫色,將燒杯口用紗布蓋好,隔夜過濾,在過濾液內每96 ml中加4 ml冰醋酸,放置1周后成熟,即可用于染色,保存期1~2個月。此染液在加醋酸后,對核染色特具選擇性,故很適于脫落細胞的核染色。由于染液內已加有氧化劑,故不能長期儲存,但利于配后即用。
    2Mayer蘇木精掖
    蘇木精 1g
    鉀礬或銨礬 50g
    碘酸鈉 0.2g
    蒸餾水 1000ml
    水合氯醛 50g
    枸櫞酸 1g
    將蘇木精,鉀礬及碘酸鈉依次加入水內,略加熱并攪拌,此時液體呈藍色,待全溶后過夜。再加入水合氯醛及枸櫞酸并加熱至煮沸5分鐘,冷后過濾備用。如不急用可不煮沸而在室溫待其成熟,染液可較長期貯存使用。核染色鮮明,染色時間5—10分鐘。用該染液染色后,不需分化,充分水洗藍化后即可,伊紅復染細胞質,使用一段時間后就要換新溶液。
    3Hasnsen甲礬蘇木精的配制
    A液:蘇木精 1g
    無水乙醇 10ml
    B液:鉀礬 20g
    蒸餾水 200ml
    C液:高錳酸鉀 1g
    蒸餾水 16ml
    三液分別溶化后,將A液倒入B液,再加入C3ml,充分攪拌均勻后加熱至沸騰,1分鐘左右,將容器置于冷水中使其迅速冷卻,此液配后即可使用,染后無需堿化,細胞核即為藍色,效果較好,高錳酸鉀可以迅速化蘇木精(每1g蘇木精需0.177g高錳酸鉀氧化)。
    4.伊紅
    0.5~1%水溶液或酒精溶液。
    1.水溶性伊紅
    伊紅 5~10g
    蒸餾水 1000ml
    冰醋酸 10
    先將水溶性伊紅加入蒸餾水中,用玻璃棒攪起泡沫后過濾,再加冰醋酸。
    2.醇溶性伊紅
    伊紅 5~10g
    70%~90%酒精 1000ml
    冰醋酸 10
    (四)其它
    1.麻醉劑:
    2~4%戊巴比妥鈉,1ml/kg體重(45mg/kg)。
    2.各級濃度酒精的配制
    75%;85%;95%;100%酒精。75%85%酒精用95%酒精配制;(取75ml95%酒精,加水至95ml,即為75%酒精)
    3.鹽酸灑精
    多用于多種染色過程中的分色,如蘇木精染色后分色。配法是在100ml70%酒精內加0.5~1ml的濃鹽酸(Hcl)。用鹽酸酒精分色后要經自來水充分沖洗組織切片,去除所含的酸再作其他處理。
    4.碘酒
    取碘5g,溶于95%酒精80ml,再加入20ml蒸溜水即成
    5.生理鹽水
    以氯化納0.85~0.90g溶于100m1蒸餾水配成的生理鹽水適用哺乳動物

     

     

     

     

     

    石蠟切片基本步驟之二 取材 固定

    三、取材,固定
    (一) 實驗動物的抓取及固定
    1.小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法
    要點:(1)動作要輕緩;(2)不要突然襲擊;(3)如發現動物的毛發豎起來時,最好停一會后再抓;(4)將四肢打開,固定在木板或方形蠟板上。
    2.實驗家兔的抓取及固定方法
    要點:(1)隨時撫摩其頭部;(2)防止被其腳爪抓傷;(3)根據實驗要求選擇固定方法。
    3.豚鼠的抓取及固定方法
    要點:先用一只手扣住豚鼠背部,然后抓緊兩耳間頭頸部的皮膚,用另一只手托起臀部送到動物固定臺上。
    (二) 實驗動物的編號、標記、分組和被毛去除方法
    1.編號和標記方法
    1)染色法
    標記溶液:3%~5%苦味酸 黃色
    2%硝酸銀 咖啡色(涂后光照10分鐘)
    0.5%中性紅或品紅 紅色
    龍膽紫 紫色
    編號原則:先左后右,從前到后
    左前腳為1,左側腹為2,左后腿為3,頭頂為4,腰背部為5,尾基為6,右前腳為7,右側腹為8,右后腿為9。超過10可用不同的染色的標記液,一種染色為個位,另一種為十位數。
    2)掛牌法
    3)耳孔法
    一般來說,小型動物適宜用耳孔法和染色法,中型動物適用于掛牌法。
    2.實驗動物的隨機分組方法
    動物實驗時,常常需要將選擇好的實驗動物,按研究需要分成若干個組,分組時為了避免人為因素的影響,常應用隨機數字表進行完全隨機化的分組。
    3.實驗動物被毛去除方法
    剪毛法
    拔毛法
    剃毛法
    脫毛法:系用化學脫毛劑將實驗動物被毛脫去,適用于無菌手術野的準備以及觀察動物皮膚血液循環和病理變化。方法:將需脫毛部位的被毛先用彎頭剪刀剪去,盡量剪短,勿剪破皮膚。然后用溫水將該部位潤濕,再用紗布包扎棉球的小棒蘸脫毛劑,在需脫毛部位涂一層,經2~3min后,用溫水洗去該部位脫下的毛,自然晾干備用,切勿用紗布去擦,以免損傷皮膚。
    脫毛劑配方:
    1)硫化鈉3g
    肥皂粉1g
    淀粉7 g
    加水適量調成糊狀
    2)硫化鈉8g
    溶于100ml水中
    3)硫化鈉8g
    淀粉7 g
    4 g
    甘油5 g
    硼砂1 g
    加水75ml
    (三) 實驗動物處死
    處死動物的方法很多,無論是采用哪種方法,都要盡力避免使動物長時間陷于痛苦和瀕于死亡狀態。熱愛生命,珍愛動物。
    1.空氣栓塞致死法
    要點:(1)常用于大的動物(如:兔、貓、狗和猴等);(2)用50~100ml注射器一只;(3)此方法迅速、方便,但各臟器淤血明顯。
    2.麻醉后處死法
    注:采用此方法,取材后一定要確定動物是否已死亡,最好再行斷頸。
    1)吸入麻醉法
    要點:(1)適用于較小的動物(小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等);(2)用乙醚浸泡過的脫脂棉;(3)時間大約1~2分鐘;(4)注意防火
    2)注射麻醉法
    要點:(1)適用范圍較廣;(2)注射方式可采用靜脈、腹腔、皮下和肌內注射,最常用的是腹腔注射;(3)注射致死量一般視動物大小而定。
    3.腦、脊破壞法
    要點:(1)常用于蛙類;(2)用金屬針經枕骨大孔進入,破壞大腦和脊髓。
    4.斷頭處死法
    要點:(1)常用于小動物;(2)用剪刀剪斷頸椎;(3)如果沒有特殊要求,最好不要使頭和軀干分離。
    5.斷椎法
    要點:(1)常用于大白鼠和小白鼠;(2)一手固定頭部,一手拽住實驗動物的尾部,輕輕一拉扯斷其頸椎,使其脫位,椎管內急性損傷癱瘓或死亡后取材;(3)此方法處死動物組織結構保存較好。
    (四) 實驗動物解剖
    解剖步驟
    1.實驗動物被麻醉或處死后,將其;固定在動物解剖臺上,用紗布蘸取生理鹽水濕潤被毛;
    2.從下頜至恥骨聯合沿正中線切開皮膚;
    3.打開腹腔:沿肋骨下緣腹正中,用鑷子提起腹壁切開腹壁肌肉,至恥骨聯合,從肋骨下端向脊柱方向,將兩側腹壁剪開,充分暴露腹腔內臟器;
    4.打開胸腔:用剪刀沿肋骨的肋軟骨和骨的連接處由下向上剪開,不要剪斷鎖骨,剪時應盡量貼著胸內壁,并注意不要剪斷胸骨兩側的大血管。然后將肋弓提起,暴露腹腔內臟器。
    (五) 取材
    取材一定要迅速,應在動物處死后立即進行解剖和切取組織材料,否則會引起細胞發生死后變化(如組織自溶及腐敗現象等),進而失去原有的結構,如果進行酶組化染色,將會使大量的酶失活和丟失。
    取材方法和注意事項
    1)取材用的刀剪必須鋒利,取材時應用鑷子夾該組織的周圍的結締組織,凡是用鑷子夾過的或用手壓過的組織均不可用。
    2)根據實驗要求選擇不同的取材方法(整體取出臟器法、單個臟器取出法和切取組織塊法等)
    3)取材的先后順序原則。根據死后組織結構改變的速度的快慢而定。先腹腔后胸腔,先消化管后肝、脾等多血的器官及神經組織。
    4)取材組織塊的大小既要保證組織的完整性,又要力求小而薄,一般以1.0cm×1.0cm×0.5cm為好,但有些特殊要求的可視情況而定。
    5)較小的組織或器官(淋巴結、松果體、腦垂體和神經節等)應整體固定,但要破壞其表面一側的被膜。
    6)管狀及囊狀組織(消化管的取材)都不應斜切,先將一段腸管或食管剪下,從中剪開管腔,使之成片狀,然后將其鋪在紙板下,黏膜面朝上,用大頭針或細線將四邊固定,用生理鹽水漂洗黏膜表面,然后固定。
    7)較細的管狀臟器(輸尿管、輸精管、輸卵管、中動脈和靜脈等)應取下1~2cm長,平鋪于硬紙片上或吸水紙上分段固定。
    8)取材要盡量注意臟器的完整性。
    9)應根據所要觀察的部位及實驗目的進行選擇組織的切面。對于病理材料,除切取病變部位外,還要切取病變和正常組織交界部分的區域,以利于進行正常組織與病理組織的對比觀察分析。
    10)取材時要注明取材時間、組織器官名稱、固定液名稱、組織塊的數量、所取組織位于器官的部位等,以備查。
    (六) 固定
    1.固定的目的
    1)防止組織溶解及腐敗,以保持組織和細胞與正常生活時的形態相似;
    2)使細胞內蛋白質、脂肪、糖、酶等各種成分轉變為不溶性物質,以保持它原有的結構與生活時的相仿;
    3)組織細胞內的不同物質經固定后可以產生不同的折光率,對染料也產生不同的親和力,造成光學上的差異,使得在生活情況下原來看不清楚的結構變得清晰起來,并使得細胞各部分容易著色,有利于區別不同的組織成分。
    4)固定劑的硬化作用,增加組織硬度,便于制片。
    2.固定的對象和方法
    1)固定的主要對象是蛋白質;
    2)固定液的量要足夠,其固定液的量一般不少于組織總體積的10倍以上(一般為120)。對于某些需要制作神經染色和酶組織化學染色的組織固定,比一般的固定要嚴格。
    3)特殊的固定方法(注射或灌注固定):某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內部或需要對整個臟器或整個動物進行固定,宜采用此方法,將固定液注入血管,經血管分支到整個組織和全身,從而得到充分固定。
    局部灌注固定:
    肺:肺內含有空氣,固定難以滲入,可將固定液從氣管、支氣管或肺動脈注入固定液,從支氣管注入時速度一定要慢,量不宜過多。注射固定后可將整個肺投入固定液中6~12小時,再分別切成小塊。
    肝、腎:經肝動脈或腎動脈注入固定液。
    腦:動物麻醉后暴露頸動脈,以注射針尖向著關部的方向注入固定液。
    全身灌注固定:
    步驟:取大白鼠,1%戊巴比妥鈉麻醉,打開胸、腹腔,縱向切開心包,用紗線在主動脈弓起始部,然后用50ml注射器,選用適當針頭,從左心室向主動脈方向刺入,將紗線扎緊固定,在右心房開一孔放血,取用與動物等量的生理鹽水注入血管中洗滌,待洗滌處的液體不見血時,再注入固定液。待動物體有一定硬度時即可取材,將所需組織從動物身上切去后,經適當處理,即投入固定液中(甲醛或多聚甲醛)
    3.固定液的性質和條件
    1)能迅速滲入組織,使組織細胞形態在短期內不至于有較大變化。
    2)固定液有相當的滲透力,對組織各部分的滲透力相等,可使組織內外完全固定。
    3)使組織細胞不至于因固定而引起人為的改變。
    4)盡可能避免固定劑使組織膨脹或收縮。
    5)使組織達到一定硬度,獲得較佳的折光率和對染料具有較強的親合力。
    4.固定時應注意的事項
    1)固定液及被固定的組織必須新鮮;
    2)固定液的用量一般為組織體積的10~20倍,容器不要過小,材料也不要太多;應避免組織緊貼瓶底或瓶壁,以免影響固定液的滲入,必要的時候可以在瓶底墊上一層棉花;
    3)固定時間視組織塊的種類、性質、大小,固定液的種類、性質、滲透力的強弱,固定時的溫度的高低,實驗目的等;
    4)防止被固定的組織因固定劑的作用而發生變形;
    5)固定所用的固定液,以新配的為好,放置過久會失效;
    6)在固定期間搖動組織或搖動容器有利于固定液的滲入,對長期固定的標本,可經常更換固定液
    7)取材固定應同時作好記錄,包括組織名稱、固定液和時間等內容。
    5.固定劑
    單純固定劑
    110%甲醛:對組織滲透性強,固定均勻。對組織膨脹約5%,經酒精脫水時有較大的收縮。能保存脂肪,不能沉淀核蛋白及白蛋白,長期用其固定的組織使組織變為酸性,不利于染色,特別是細胞核的著色。經自來水沖洗6~24小時后,可以使其酸堿中和,并減少結晶。
    24%多聚甲醛:對組織穿透性好,組織收縮小,對大多數抗原物質保存較好,特別是對脂肪和各種酶的固定效果更好。固定的時間不宜太長,以24小時以內為宜,適用于免疫組織化學染色。
    3)飽和的苦味酸溶液:能沉淀一切蛋白質,滲透力弱,對組織收縮大,故一般不能單獨使用。
    4)冰醋酸:滲透力強,沉淀核蛋白,對染色質固定好,使組織膨脹,故一般不單獨使用。
    5)鋨酸:價格昂貴,為強化劑,易還原成氫氧化鋨,呈黑色沉淀;必須避光保存。不能沉淀蛋白質,而使蛋白質凝膠化,所以對蛋白質固定不均勻,鋨酸固定的細胞能保持生活時的形態,不收縮細胞,對胞質固定較長好,核的固定不好,鋨酸為脂肪及類脂質的優良固定劑,經它固定的脂肪和類脂質呈黑色,特別是對于是顯示線粒體和高難度爾基復合體效果良好。
    混合固定劑
    1Bouin氏固定液:為常用的良好的固定劑,穿透速度快,組織收縮性較小,固定均勻,固定后組織有適當的硬度,對于切片和染色均有良好的效果。一般固定12~24小時,固定后入70%酒精洗去苦味酸的黃色,在脫水時經各濃度酒精也可洗去黃色,在酒精中加入氨水一滴或少許碳酸鉀飽和水溶液,可加快洗去苦味酸的黃色即使留有少量苦味酸的黃色,對一般染色體并無影響。
    2Zenker液(PH2.3):此液多用于一般組織的固定,它能使細胞核、細胞質染色清晰但固定時間長,一般要12~36小時,加熱可以縮短固定時間。固定后的組織必須流水沖洗12小時,由于固定中含有升汞,在經70%酒精脫水時,加少量的碘液(0.5%碘酒精)以脫汞。
    3Carnoy液:滲透力強,特別適宜于固定染色體、肝糖、粘液等一些較為細微的結構。顯示DNA、RNA效果良好。
    4)改良Bouin氏固定液:此液對一般組織固定效果都很好,固定時間為4~18小時,固定后直接放70%乙醇脫水,固定時間較長對組織亦無損害。
    (七) 組織塊修整
    固定后的組織塊可能會在外部形態上有些改變,或者由于組織在還未固定時就取材,組織器官較軟,取材不容易切平。經固定后的組織有一定的硬度,此時就可以做一些修整,但改變不要太大,只是將組織材料切取平整,修掉一些不規則的部位。修整組織塊時,手術切片一定要鋒利。

     

     

     

     

     

     

     

    石蠟切片基本步驟之三 水洗,脫水,透明,浸蠟包埋

    四、水洗
    1.目的:
    洗去滲入組織中的固定液,終止固定。以免影響對組織內結構的觀察、分析和研究。
    2.原則和方法:
    固定后的組織塊的沖洗,一般情況下是置水龍頭下以自來水流水沖洗,這樣可以使組織中的固定液隨時溢出,洗得更干凈徹底,有些還需要進行特殊的洗滌。
    1)各種以水配制的固定液如甲醛,都必須用流水沖洗,大塊組織一般沖洗24小時,小塊組織一般沖洗2—10小時。
    2)固定液為多聚甲醛時,用于免疫組織化學等特殊染色的應將組織投入PB緩沖液中,每60分鐘更新洗滌液一次,累計6小時。
    3)固定液為酒精或是酒精混合液,一般不需用水沖洗,其組織塊的洗滌應用與固定液濃度相等垢酒精換洗或者直接進行脫水的程序。
    4)用鋨酸或含有鋨酸的固定液固定的組織,必須用流水徹底沖洗干凈。
    5)經含有苦味酸的固定液固定的組織塊,無論其固定液是水溶性還是酒精溶性,都應充分沖洗,水溶性固定液固定的組織塊一般須沖洗12小時,再進入70%的酒精溶液洗滌,酒精溶性固定液固定的組織塊直接進入70%的酒精溶液洗滌,該溶液可以脫掉苦味酸的黃色,但最好從50%酒精開始洗滌。
    6)沖洗好的組織可存放在75%酒精內
    五、脫水包埋
    (一)脫水
    1.脫水的目的
    組織內的水不能和支持劑混合,所以必須把組織中的水分徹底脫除。脫水有利于組織的透明和浸蠟,有利于組織的永久保存。
    2.脫水劑
    1)乙醇:可作固定劑,又可脫水劑,但乙醇與水混合時有較劇烈的物理反應。高濃度的酒精對組織有強烈收縮及脆化的缺點,因此用乙醇脫水不能直接入純酒精中脫水,而必須經過由高到低的一系列不同濃度的酒精,逐漸取代組織中水分,以保證組織脫水徹底,并避免組織過度收縮和硬化。
    2)丙酮:脫水能力比酒精強,但對組織的收縮更大,在組織學制片中較少使用,多用于病理快速切片,或用于某些組化水解酶的固定。
    3)正丁醇:是較好的脫水兼透明劑,可與酒精及石蠟混合,用于脫水是可先經過各種不同濃度的正丁醇和乙醇混合液,再入正丁醇,進行石蠟包埋時,可先用正丁醇和石蠟等量混合液,然后浸入純石蠟包埋,正丁醇用于脫水的優點是很少引起組織收縮和脆硬,可替代二甲苯,是很好的脫水劑,但由于價格較貴,不常使用。
    3.步驟
    1)乙醇脫水過程
    50%乙醇 6~8小時
    75%乙醇 6~8小時
    85%乙醇 3~5小時
    95%乙醇 1~2小時
    95%乙醇 1~2小時
    100%乙醇 1小時
    100%乙醇 1小時
    2)丙酮脫水
    如果是丙酮固定的組織,則不必再經過乙醇,可以用新丙酮更換一次,便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的組織,均按上述乙醇脫水方法脫水,亦可由100%乙醇中移入丙酮繼續脫水2~4小時再入二甲苯透明,透明后浸蠟包埋。
    3)正丁醇脫水
    組織用正丁醇脫水前,先經50%乙醇脫水,然后移入正丁醇和乙醇混合液進行脫水。
    50%乙醇 6~12小時
    50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸餾水 5~8小時
    50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸餾水 4~6小時
    45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸餾水 3~5小時
    25%乙醇+75%正丁醇 2~3小時
    25%乙醇+75%正丁醇 1~2小時
    15%乙醇+85%正丁醇 1~2小時
    5%乙醇+95%正丁醇 1~2小時
    100%正丁醇 1小時
    100%正丁醇 1小時
    4.注意事項:
    1)脫水的過程應逐步地而不應驟然地進行,不能操之過急。
    2)脫水的時間應根據組織塊的大小和組織的類型而定。
    3)組織塊在高濃度,特別是無水乙醇內不能放置的時間太長。無水乙醇吸水能力太強,容易造成組織塊的過度硬化,使得切片理組織易碎裂。
    4)在脫水的過程中可以將組織塊停留在70%~80%的酒精中。
    5)每次更換新的脫水劑時(組織塊從低濃度到高濃度),都要把組織塊放在吸水紙上吸干,裝組織塊的容器也要控干水分,以免將水及低濃度脫水劑帶入高濃度脫水劑中,影響脫水效果。
    6)脫水劑的先擇要根據實驗的要求及實驗室的條件
    (二)透明
    1.透明的目的
    置換組織內的脫水劑,為下一步的浸蠟起到橋梁作用;
    使組織呈現不同程度的透明狀態,有利于光線的透過。
    2.透明劑
    1)二甲苯:是現在應用最廣的一種透明劑,價格較便宜,不能和水混合,遇水則變成乳白色渾濁,因此必完全脫水后才能使用;易溶于酒精又能溶解石蠟,透明力強;其最大的缺點是容易使組織收縮變硬變脆,所以組織不能在其停留過久,透明時間視組織塊的大小、性質而定;有的組織如肌肉、肌腱、軟骨、骨、皮膚、頭皮及眼球等,不宜用二甲苯透明,因組織過硬不易切片;長時間接觸,對粘膜有刺激作用。
    2)苯:性質與二甲苯相似,對組織收縮也較小,組織也不易變脆,但透明較慢,組織在其內可以滯留12~24小時,但毒性較大。
    3)香柏油:用為透明劑,效果很好,有高度透明作用,能與醇和二甲苯混合,香柏油對組織的硬化及收縮程度比任何其他透明劑都要小,但透明的速度較慢,3mm以下厚度的組織塊需12小時以上。香柏油與石蠟不易融合,即香柏油不易被石蠟取代,因此經香柏油透明以后,可經過二甲苯短時間媒浸,再進行石蠟包埋。肌肉、皮膚、血管、膀胱、垂體及腎上腺等用香柏油效果較好。
    3.二甲苯的步驟:兩次透明
    第一次透明約40分鐘
    第二次時間不一定,要視透明效果而定
    4.注意事項
    1)時間不宜過長,否則組織會變脆;
    2)組織塊脫水必徹底。
    (三)浸蠟、包埋(石蠟包埋法)
    1.浸蠟
    1)浸蠟的目的
    置換組織中的透明劑,為包埋做準備。
    2)浸蠟的步驟
    60度恒溫蠟箱中放置3個蠟杯,分別編號152~54)、252~54,或54~56)、356~58),其中分別盛軟蠟、軟蠟、硬蠟,取透明好的組織塊放入軟蠟中各1小時,迅速取出放入硬蠟,同樣放置1小時。如果時間來及包埋,可以將已經完成浸蠟的組織塊取出放在溫箱外,第二天繼續。
    3)注意事項
    溫箱中的溫度必須嚴格控制在60的范圍,不能超過60;浸蠟時間不宜過長。浸蠟溫度過高或時間過長使組織收縮過度收縮和脆變。
    2.包埋
    1)步驟
    準備包埋蠟:一般應用硬蠟(56~5860~62)為好,所用的石蠟要求透明無雜質,新的石蠟要反復熔凝,并有一定的粘韌性,可以加一些蜂蠟。蠟的熔點應與組織的硬度相適應。包埋用過的石蠟可以反復使用。
    準備包埋框:可以用金屬的,也可以用硬紙摺疊。
    點燃酒精燈,準備好無齒尖鑷子,需作標記應先寫好標簽。
    在金屬框中倒入硬蠟,然后用無齒鑷子取組織塊放入石蠟中,置好方向??墒覝叵吕鋮s。
    包埋框或紙盒內的蠟逐漸凝結,若表面已凝結形成一層固體狀,即可放入冷水中,加速其凝固。
    待蠟塊完全凝固以后,便可拆卸包埋框架, 或拆開紙盒,取出蠟塊。
    2)注意事項
    包埋時夾取組織的鑷子,用酒精燈隨時燒熱,以免石蠟凝結后粘附在鑷子上,造成蠟塊凝固不均勻。
    包埋操作要迅速,組織從浸蠟杯中取出置入包埋框中的時間應盡量縮短。
    包埋后的蠟塊應呈均質半透明狀,如果出現白色混濁狀,一般出現在組織周圍或組織的底部,應考慮這樣幾個方面的問題:a. 脫水不徹底。b.包埋蠟溫度低了,組織進行包埋時,包埋框中的蠟已成凝結狀。c.組織內還殘留有較多的透明劑,d.石蠟不純。
    包埋箱中的溫度必須保持恒定。
    如包埋得不好,可將蠟塊溶化,重新浸蠟和包埋。
    較小的組織可在脫水透明時開始用伊紅染色

     

     

     

     

     

    石蠟切片基本步驟之四 切片

    六、石蠟切片制備
    (一)石蠟切片前的準備
    1.切片刀。傳統的切片刀在使用之前,一定要在顯微鏡下檢查刀口的損傷程度,然后進行磨刀?,F在也可以使用一次性刀片,可省去磨刀。
    2.修整蠟塊:切去組織周圍過多的石蠟,一般情況下在組織周圍留有約1~2mm的石蠟邊,兩邊必須平行。
    3.蠟塊固定:修整好的蠟塊先固定在事先準備好的小方木塊或者金屬塊上,固定方法是把蠟鏟先在酒精燈上加熱,再將蠟塊底部烙熔,迅速烙粘在小方木塊或金屬塊底座上。
    4.載玻片擦洗干凈后,在其表面涂上粘附劑(蛋白甘油、APES或多聚賴氨酸),根據染色方法選擇不同的粘附劑。
    5.準備好毛筆、鑷子、染色架。
    6.調好展片器內水的溫度(45),有時也可以加些酒精到水中。
    (二)石蠟切片
    1.將切片刀裝在刀片機的刀架上并固定緊,固定蠟塊底座或蠟塊,調整蠟塊與刀至合適位置,刀刃與蠟塊表面呈5度角。
    2.切片多使用輪轉式切片機,切片時,左手執毛筆,右手轉切片機轉輪,先修出組織塊。
    3.調整切片機上的切片厚度為4~7μm,然后切片。
    4.切片可以是單張,也可以是連續切片形成蠟帶
    5.展片和撈片:
    1)直接展片法:在載玻片上滴加幾滴蒸餾水,然后把切片鋪在小滴上面,用酒精燈在載玻片下面加熱,待完全展平,傾斜載玻片,倒棄多余水分,同時擺正切片。
    2)溫水漂浮法:此法用展片機或者用恒溫水浴箱,先使水溫保持在45~50,用左手拿毛筆輕輕托起切片,用右手用眼科鑷子夾起切片的一角,正面向上輕輕平鋪放置于展片器的水面上,動作要輕快,切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作用會自然平整地展開,必要時可用眼科鑷輕輕拔開,然后撈片,并及時編號。
    6.展好的切片在室溫下稍微干燥后,放在40恒溫烤箱中,小片組織30分鐘即可,大的需12~24小時,烤干備用。
    (三)注意事項
    1.切片刀刃傾斜過大或過小都不能正常進行切片。
    2.修整蠟塊時要細心,看清楚組織在蠟塊中的位置,以免將需要的組織修掉。
    3.連續轉動切片機的轉輪時,速度一定要均勻,不能時快時慢,以免切片厚薄不一。
    4.使用輪轉式切片機切片時,是由下向上切,為得到定然整的切片,防止組織出現刀紋裂縫,應將組織硬、脆難切的部分放在上端,如皮膚應將表皮部分向上,腸胃等組織應將漿膜面面朝上。
    5.用展片器展片時,水溫應根據使用的石蠟熔點進行了調整,一般低于石蠟熔點10~15;撈片的時候動作要輕、稍快。動作太大容易出現氣泡。如果沒有展片器可以用溫水浴鍋來代替。
    6.單個切片要擺到載玻片的1/32/3交界處;連續切片的粘片順序一般是從左到右,組織切片較小是,可以并列粘貼2~3條蠟帶。
    7.烤片的溫度不宜過高;烤片的時間要合適。腦組織要待稍微晾干一些后,才能烤片,否則容易產生氣泡影響染色和觀察。
    七、H-E染色
    (一)步驟
    1.脫蠟
    二甲苯I 10分鐘
    二甲苯II 5分鐘
    2.水化
    100%酒精I 5分鐘
    100%酒精II 5分鐘
    95%酒精I 5分鐘
    95%酒精II 5分鐘
    85%酒精 3分鐘
    75%酒精 2分鐘
    蒸餾水沖洗 1分鐘
    3.染色
    蘇木精染色 5分鐘
    自來水洗
    鹽酸酒精分化 15
    自來水洗(鏡檢)
    自來水洗 15分鐘
    0.5%伊紅染色 1分鐘
    蒸餾水洗 2分鐘
    75%酒精 2分鐘
    85%酒精 2分鐘
    95%酒精I 5分鐘
    95%酒精II 5分鐘
    100%酒精I 5分鐘
    100%酒精II 5分鐘
    二甲苯I 5分鐘
    二甲苯II 5分鐘
    4.封片
    中性樹膠封片
    上述處理好的玻片,取中性樹膠滴入載玻片的組織上,取蓋玻片從一端逐步蓋下去,避免發生氣泡
    (二)注意事項
    1.染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法,不同的染色液染色后的處理是不一樣的。
    2.染色過程中所用的時間要根據染色時的室內溫度、染液的新鮮程度及實驗室的實際情況等靈活掌握。在室溫高、切片、染色液又是新配制的,染色時間就要短,反之時間就長。
    3.伊紅有水溶的和醇溶的,如果用的是水溶的,應該在脫水前進行染色,如果是醇溶的,應使用與溶解伊紅等濃度的酒精開始脫水。
    4.在二甲苯脫蠟之前可以先在60烤箱內0.5~1小時,這樣可以使切片粘附更牢固不易脫片,也有利于脫蠟。
    5.二甲苯在HE染色中有脫蠟、透明的作用。二甲苯脫蠟的好壞主要取決于切片在二甲苯內放置的時間和脫蠟時的溫度以及二甲苯的使用次數。染好的切片必須經過透明,有利于顯微鏡觀察,同時并為封片起到了橋梁作用。
    6.用梯度酒精脫水時,在低濃度酒精中時間不宜過長,到高濃度時逐步延長脫水時間。以免脫水不徹底,影響二甲苯透明的效果。
    7.在酸性分化液內停留的時間不要過長,分化不可過度,避免使細胞核內該染上色的結構脫色。不需分化處理的蘇木精染色時要注意掌握染色時間,以防止組織切片染色背景過深或細胞核、胞質染色不足。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    光學顯微標本的制作技術
    【實驗目的】
    了解光學顯微鏡切片制作技術的基本方法步驟。
    【實驗原理】
    采用光學顯微鏡研究一般生物體的內部結構,在自然狀態下是無法觀察清楚的,多數動、植物材料都必須經過某種處理,將組織分離成單個細胞或薄片,光線才能通過細胞。為了適應這個需要,就產生了光學顯微鏡制片技術。
    光學顯微鏡的制片技術方法可分為兩大類:一類是非切片法,另一類是切片法。
    非切片法,是用物理或化學的方法,使細胞彼此分離,如有分離法、涂布法、壓碎法等。非切片法的操作比較簡單,能保侍細胞的完整,但是細胞之間的正常位置往往被更動,無法反映細胞之間的正常聯系。它可以與切片法配合使用,各取其長處。
    切片法,是利用銳利的刃具將組織切成極薄的片層,材料須經過一系列特殊的處理,如固定、脫水、包埋、切片、染色等,過程十分繁復。在制作過程中,還要經過一系列的物理和化學的處理,這些處理方法可根據各種不同材料的性質要求進行合理選擇。切片法雖然工序繁瑣,技術復雜,但是,它最能保持細胞間的正常的相互關系,能較好和較長時間地保留細胞的原貌,所以仍然是光學顯微鏡的主要制片方法。
    【實驗儀器、材料和試劑】
    (一)儀器:石蠟切片機、恒溫蠟箱、載玻片、蓋玻片
    (二)材料:洋蔥根或小鼠肝
    (三)試劑:乙醚、無水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重鉻酸鉀、鋨酸、正丁醇、二甲苯、石蠟、甘油、雞蛋、紗布、加拿大樹膠、麝香草酚
    【方法與步驟】
    光學顯微鏡切片制作技術最簡單的切片法是徒手切片,但是由于組織塊往往十分柔軟,
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    切削很困難,而且無法得到十分菲薄的切片,因此必須先用某些特殊物質滲入組織塊的內部起支持作用,并將整個組織塊包住,然后再用精密的切片機制作切片,才能獲得良好的效果。這種方法稱為包埋法,包埋的物質稱為包埋劑。常用的包埋劑有石蠟、火棉膠、炭蠟、明膠等,水和塑料也可作為包埋劑。根據包埋劑的不同,分別有石蠟切片、火棉膠切片、冰凍切片等,它們各有長處,可以根據需要選用,但是使用得最多的還是石蠟切片技術。
    石蠟作為包埋劑,有其獨特的優點,例如:石蠟能切出極薄的蠟片(210μm);切片時能連成蠟帶,便于制作連續切片;操作較容易,組織塊可以包埋在石蠟中長期保存。然而石蠟切片的制作過程較長,步驟很多,一步不慎往往導致前功盡棄,而且這些處理引起組織塊或多或少地收縮,切片時受濕度影響比較大,這些不足之處必須在制片過程中認真對待,盡量減小它的不良影響。
    石蠟切片的制作過程主要包括:取材,固定,脫水,透明,透蠟,包埋,切片,貼片,染色,透明,封藏等步驟。
    1.取材
    材料的好壞直接影響到切片的質量,無論取哪一種動植物材料,以下幾點是必須注意的。
    1)植物材料選擇時須盡可能不損傷植物體或所需要的部分;動物材料取用時常對動物施以麻醉,常用的麻醉劑有氯仿和乙醚,或將動物殺死后迅速取出所需要的組織。
    2)取材必須新鮮,這一點對于從事細胞生物學研究尤為重要,應該盡可能割取生活著的組織塊,并隨即投入固定液。
    3)切取材料時刀要銳利,避免因擠壓細胞使其受到損傷。
    4)切取的材料應該小而薄,便于固定劑迅速滲入內部。一般厚度不超過2mm,大小不超過5×5mm2。
    2.固定
    組織和細胞離開機體后,在一定時間內仍然延續著生命活動,會引起病理變化直至歸于死亡。為了使標本能反映它生前的正常狀態,必須盡早地用某些化學藥品迅速地殺死組織和細胞,阻抑上述變化,并將結構成分轉化為不溶性物質,防止某些結構的溶化和消失。這種處理就是固定。除了上述作用外,固定劑會使組織適當硬化以便于隨后的處理,還會改變細胞內部的折射系數并使某些部分易于染色。
    固定劑的作用對象主要是蛋白質,至于其他成分如脂肪和糖,在一般制作時不加考慮,如要觀察這些物質,可用特殊的方法將其固定下來。
    固定劑的作用表現在對材料體積的改變、硬化的程度、穿透的速度以及對染色的影響等方面。這些作用的好壞、大小,都依所固定的材料性質而定,同樣一種固定液對某一材料來說是良好的,但對另外一些組織可能就不很適用。良好的固定劑必須具備的特征是:穿透組織的速度快。,能將細胞中的內含物凝固成不溶解物質,不使組織膨脹或收縮以保持原形,硬化組織的程度適中,增加細胞內含物的折光度,增加媒染和染色能力,具有保存劑作用。 固定劑有簡單固定劑和混合固定劑的劃分。
    簡單固定劑即單一的固定劑,常用的有乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞、苦味酸、鉻酸、重鉻酸鉀和鋨酸。其中,苦味酸、升汞、鉻酸既能凝固細胞清蛋白,又能凝固核蛋白;乙醇只能凝固清蛋白,而醋酸只能凝固核蛋白;甲醛、餓酸和重鉻酸鉀對這兩種蛋白質都不凝固。
    簡單固定劑的局限性較大,如將其適當混合,制成復合固定劑可以取得更好的效果。常用的混合固定劑有:
    Bouin液(70份苦味酸飽和水溶液+254%甲醛+5份冰醋酸)、Zenker液(升汞5g+重鉻酸鉀2.5g+硫酸鈉1.0g5ml冰醋酸+100ml蒸鎦水)、Carnoy改良液(3份無水乙醇+1份冰醋酸)等。固定劑的種類甚多,我們必須依據各種固定劑的性能及制片的不同要求來加以選擇。 19
    固定時,須注意以下幾點:
    1)固定劑應有足夠的量,一般為組織塊體積的1015倍。
    2)如所固定的材料外表有不易穿透的物質,可將材料先在含乙醇的溶液中固定幾分鐘,再移入水溶性的固定液。
    3)材料固定后如不立即下沉,可將其中氣泡抽出。
    4)固定時間依材料大小、固定劑種類而異,可從1小時到幾十小時,有時中間需要更新固定劑。某些固定劑對組織的硬化作用較強,作用時間應嚴加控制,不能過長。
    5)一般固定劑都以新配制的為好,用過的不能再用。有些混合固定劑由甲、乙兩液合并者,一定要在使用前才混合。
    6)固定完畢,根據所用固定劑的不同,用水或乙醇沖掉殘留的固定劑,以免固定劑形成沉淀,影響以后組織塊的染色。
    3.脫水
    生物組織中含有大量的水分,它和石蠟是不能相溶的,致使在包埋時石蠟無法滲入組織內部,因此須使用脫水劑將水分除盡,這就是脫水的作用。
    脫水劑必須能與水以任何比例相混合。脫水劑有兩類:一類是非石蠟溶劑,如乙醇、丙酮等,脫水后必須再經過透明,才能透蠟包埋;另一類是兼石蠟溶劑,如正丁醇,脫水后即可直接透蠟。
    常用的脫水劑是乙醇,因為它價格便宜,易于得到。為了避免劇烈的擴散引起的組織的強烈收縮,脫水步驟應從低到高以一定的濃度梯度來進行,一般組織從30%乙醇開始,經過50%、70%、80%、95%、100%至完全脫水;對于一些柔軟的組織應從15%開始。脫水時間依據組織的類型和大小而定,一般各級乙醇中放置45min1h,如果中間須停頓,應使材料停留在70%乙醇中,因為低濃度乙醇易使組織變軟、解體,高濃度乙醇有脆化組織作用,放置時間不能過長,另外,脫水必須在有蓋瓶中進行,以防止高濃度乙醇吸收空氣中水分導致濃度降低而使脫水不徹底。需要保存的材料可脫水至70%乙醇時停留其中,如需長期保存,可加入等量的甘油。
    丙酮也是很好的脫水劑,其作用和用法與乙醇相同,不過其脫水力和收縮力都比乙醇強。
    甘油常用于藻類、菌類及柔弱材料的脫水。
    二氧六環為無色的石蠟溶劑,對組織沒有收縮及硬化等不良后果,但其蒸氣有毒,使用時須小心。
    正丁醇可與水及乙醇混合,亦為石蠟溶劑,其優點是很少引起組織塊的收縮與變脆。
    叔丁醇的性質、作用和用法同于正丁醇,但因其價格昂貴而很少使用。
    4.透明
    組織塊用非石蠟溶劑脫水后必須經過透明。透明劑能同時與脫水劑和石蠟混合,它取代了脫水劑后,石蠟便能順利地滲入組織。
    透明劑的種類很多,較常用的是二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等。
    二甲苯作用較快,透明力強,但組織塊在其中停留過久,容易收縮變脆變硬,同時若脫水不凈,就會引起不良后果,在應用時必須特別小心。通常將組織塊先經純乙醇與二甲苯的等體積混合液,再進入純二甲苯,這樣可減少上述的缺點。透明時間應由組織大小而定,般各級停留時間在30min2h,在純二甲苯中應更換2次,總時間則以不超過3h為宜。材料經過透明,會顯示出前一步脫水的效果如何,若脫水徹底,組織則顯現透明狀態,如組織中有白色云霧狀,說明脫水不凈,須返工處理,但返工的效果往往不好。使用二甲苯透明時,應避免其揮發和吸收空氣中的水分,并保持其無水狀態。 20
    甲苯的一般性質與二甲苯相似。用法亦同,唯沸點較低,透明較慢,但不會使組織變脆。
    苯的用法同于二甲苯,對組織的收縮作用小,但須警惕其爆炸和吸入而引起中毒。氯仿適于大塊組織的透明。
    5.透蠟和包埋
    包埋用的石蠟,熔點在5060之間,應根據材料本身的硬度、切片的厚薄和當時的氣溫條件來選用。一般動物材料最常用的石蠟熔點為5256,植物材料的用5458的;切片薄的用5860的,切片厚的則用5254的;室溫1019時選用5254的石蠟可順利切片,冬季可用熔點4648的石蠟,夏季可選5658的。
    石蠟的優劣與切片的成敗密切相關。鑒別石蠟質量的方法是:將石蠟熔化后倒入紙盒使其凝結且無氣泡和裂痕,3035放置24h且無氣泡和不透明的晶狀小點出現,蠟塊裂面不呈顆粒狀,切成薄片不碎成細粒。這種石蠟即為品質優良。含有雜質的新蠟或用過的廢蠟可清潔后再用,方法是將石蠟放入鍋內,加熱到開始冒白煙,然后用小火繼續加熱30min(注意別超過發火點),使其去除水分和揮發性雜質,并在溫箱中過濾以去除灰塵等顆粒。
    透蠟須在恒溫箱中進行,恒溫箱的溫度調節至高于石蠟熔點3度,使經過透明的組織塊依次用石蠟與二甲苯的等量混合液、純石蠟處理。純石蠟應處理23次,透蠟的時間依材料性質而定,一般每次需1530min。
    透明的關鍵是控制溫度的恒定,切忌忽高忽低,溫度過低石蠟凝固無法滲透,溫度過高使組織收縮發脆。
    包埋是使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟中。具體做法是;先準備好紙盒(具體折法見圖1-3及說明),將熔蠟倒入盒內,迅速用預溫的鑷子夾取組織塊平放在紙盒底部,切面朝下,再輕輕提起紙盒,平放在冷水中,待表面石蠟凝固后立即將紙盒按入水中,使其迅速冷卻凝固,30min后取出。
    包埋用蠟的溫度應略高于透蠟溫度,保證組織塊與周圍石蠟完全融為一體。石蠟的迅速冷卻也很重要,否則包埋塊中將會產生結晶。以后切片時引起碎裂。
    6.切片
    1)石蠟塊的固著與整修
    在包埋以后,就可進行切片。包埋好的石蠟塊裝上切片機進行切片前還須進行固著和整修。
    固著:一般旋轉式切片機上都附有可固著石蠟塊的金屬小盤,這也可用同樣大小的臺木替代。用加熱的蠟鏟將包埋塊粘貼于固著物上,并使組織塊朝外,便于以后迅速切出所需的片子。
    整修:用加熱的蠟鏟或刀片將固著的包埋塊四周修平,使上下兩面修成平行面,常保留組織周圍附著寬23mm的石蠟,而修好的蠟塊呈長方形。還可削去一角以便于在蠟帶上識別切片。
    2)切片機和切片刀
    切片機是用來作各種組織切片的一種專門設計的精密機械,常用的是旋轉式切片機,它的夾物部分是上下移動前后推進的,而夾刀部分則固定不動。主要部件是安裝切片刀的刀臺、安裝包埋塊的標本臺和控制切片厚度的微動裝置。切片時切片刀固定不動,轉動轉輪,標本臺上下運動并按調好的切片厚度向前推進一定的距離,組織塊上下運動一次,便在刀片上得到一張合乎厚度要求的切片。
    切片刀與切片的質量直接相關。切片前必須磨刀,方法是:將切片刀裝上刀柄、刀背夾、滴少許石蠟油在平滑的磨刀石上,將刀貼著磨刀石以背向刀口方向磨,使用完畢后應及時用二甲苯將石蠟油擦凈。
    3)切片方法
    切片前,將刀口置放大鏡下觀察,選擇刀口平整無缺刻的部分來進行切削。將所要切的包埋塊固定在標本臺上,使包埋塊外切面與標本夾截面平行,并讓包埋塊稍露出一截。將刀臺推至外緣后松開刀片夾的螺旋,上好刀片,使切片刀平面與組織切面間呈15°左右的夾角,包埋塊上下邊與刀口平行。在微動裝置上調節切片要求的厚度,調節時應注意指針不可在兩個刻度之間,否則容易損傷切片機,將刀臺移至近標本臺處,讓刀口與組織切面稍稍接觸,這時就可以開始切片了。方法是:右手轉動轉輪,左手持毛筆在刀口稍下端接隹切好的片子,并托住切下的蠟帶,待蠟帶形成一定長度后,右手停止轉動,持另一枝毛筆輕輕將蠟帶挑起,平放于襯有黑紙的紙盒內,注意切片速度不宜太快,搖動轉輪用力應均勻,防止切片機震動厲害引起切片厚薄不均勻,還應注意轉動的方向,以防標本臺后移而切不到片子。切片完畢,應及時用氯仿將切片機的有關部分擦凈。
    4)切片中存在的問題及補救方法
    石蠟切片是很不容易掌握的,有時很容易成功,有時則由于某種因素而造成切片的質量低劣,甚至完全失敗?,F將切片時經常遇到的一些缺點、可能的原因以及補救辦法列于表1-3。

    1-3 石蠟切片可能產生的問題和解決方法

    點:石蠟帶彎曲不直
    因:
    1.石蠟塊上下兩邊不平行
    2.石蠟塊的上下兩邊不和刀口平行
    3.刀口鋒利不一,局部產生差異
    4.蠟塊的一邊較另一邊為軟,或兩邊的硬度不一致
    5.材料未居蠟塊正中央
    6.材料大而形不正

    1.取下臺木,將兩邊修干
    2.調節標本臺,使兩者平行
    3.移動刀片,改用新的刀口
    4.待蠟塊冷卻后再切,或重新包埋
    5.用刀片切去部分石蠟,使材料居中
    6.在大的一邊切去少許石蠟

    點:切片分離、不能連成帶狀
    因:
    1.室溫過低
    2.石蠟過硬
    3.材料邊緣留蠟太少
    4.刀的角度不適合

    1.在切片機上方開一電燈或提高室溫
    2.在蠟塊面加一層45的軟蠟或用手指蠟摩擦塊面
    3.重新包埋
    4.矯正刀的角度

    點:切片卷起呈圓筒狀
    因:
    1.室溫過低
    2.石蠟過硬
    3.刀口太鈍
    4.刀的傾角太大

    1.提高室溫
    2.加軟蠟
    3用毛筆將蠟片攤開壓住,切2—3 片即成帶
    4.減小傾角

    點:切片粘附于切片刀,皺摺在一起
    因:
    1.室溫過高
    2.石蠟過軟
    3.刀口上留有一層石蠟
    4.刀口鈍

    1.降低室溫
    2.將蠟塊投入涼水中稍浸耒增加
    3.切片厚度,改用硬蠟包埋,用二甲苯拭去刀口的石蠟
    4.磨刀或移動刀口

    點:切片縱裂
    因:
    1.刀有缺口
    2.石蠟塊中含有顆粒、雜質
    3.刀口留有碎屑或細絲
    4.組織太硬

    1.可移動刀口
    2.將顆粒拽去
    3.清潔刀口
    4.讓包埋塊在水中浸泡

    點:切片有橫紋
    因:
    1.刀和臺木的固定螺絲太松
    2.刀口傾斜度太大
    3.刀口有石蠟屑

    1.旋緊螺旋
    2.可放平1—2。后再切
    3.用氯仿拭去

    點:切片厚薄不勻
    因:
    1.切片機有毛病
    2.夾刀不當
    3,未旋緊標本臺螺旋
    4。石蠟塊過硬

    1.矯正切片機裝置
    2.對癥治療
    3.旋緊螺旋
    4.將石蠟塊在水中浸泡

    點:每張切片厚薄不勻
    因:
    1.刀口震動,是由于材料過硬
    2.刀的傾角太大

    1。在蠟塊表面涂一層火棉膠
    2.減小傾角

    點:材料發生裂隙破碎或脫落
    因:
    1.脫水不干凈
    2.有透明劑殘留
    3.石蠟透入時,溫度過高或時間過長
    4.由于脫水劑和透明劑的影響,使組織變硬發脆
    5.材料太硬或太粗

    1.無法彌補
    2.增加浸蠟時間,重新包埋
    3.無法補救
    4.用正丁醇、叔丁醇和二氧六環等進行脫水和透明
    5.在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液

    點:切片時發生沙沙聲
    因:
    1.組織塊過硬
    2.包埋溫度過高
    3,材料內留有結晶體

    1.浸泡水中軟化
    2.無法補救
    3.無法補救

    點:石蠟塊將蠟帶抬起
    因:
    1.由于摩擦而產生靜電荷所致
    2.石蠟塊上面附有石蠟碎屑
    3.刀口上附有石蠟碎屑

    1.提高室溫
    2.用刀片將碎屑清除
    3.用二甲苯或氧仿清除

    7.貼片
    切好的切片必須貼附于載玻片上才能作進一步處理,但是切片常有細小的橫紋,必須經展平后才能貼附,否則影響染色和觀察。
    貼片一般有撈片法和燙板法。
    撈片法比較簡單,首先將切片分割開,投入到48的溫水浴中,這時切片都浮在水面上,由于表面張力的作用使切片自然展平,然后用涂有甘油蛋白溶液(將雞蛋一個打破入杯中,去除蛋黃留下蛋白,用筷子充分調打成雪花狀泡沫,然后用雙層紗布過濾至容器中,加入等量的甘油,混合,最后加入百分之一體積的麝香草酚(thymol)作防腐用,可保存幾個月到一年。)或5%明膠水溶液的載玻片傾斜著插入水面去撈取切片,使切片貼附在載玻片的合適位置,于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥。
    燙板法,是將涂有粘片劑的載玻片上涂上水,把已分割好的切片貼上去,再置載玻片于35恒定的燙板上讓切片攤干,并傾斜或用吸水紙吸去水分,最后將載玻片再度放燙板上晾干。
    要注意,不管是使用撈片法還是燙板法,所用的載玻片必須潔凈,不能有油污(檢驗法:已涂有粘片劑的載玻片上滴加數滴蒸餾水,若發現水不均勻分散而聚成滴狀,即表示載玻片不清潔,有殘留油脂等物在上面);切片的光面應朝下,否則染色過程中切片容易脫落。
    8.染色
    組織切片是無色透明的,必須進行染色后才能觀察到各種微細結構。染色方法很多,但是染色劑往往是水溶液,因此切片必須經過脫蠟而再度復水。這方法即為脫水、透明的逆過程。由于切片十分菲薄,處理的時間大大減少,一般每級停留約25min。
    染色是一個復雜的過程,兼有物理和化學作用,對其中的機制目前了解得不很清楚。研究細胞器和細胞內的重要組分都有很多現成的方法,例如顯示DNAFeulgen反應,顯示RNABrachet反應,顯示多糖的PAS反應,顯示蛋白質的Millon反應和顯示某些酶的鈣鈷法等,可以根據不同的要求來選用。
    9.透明
    染色后的切片須再次經過脫水、透明。標本經二甲苯透明后,折射率改變,透明度提高,使得染上色的部位更清晰地顯示出來。
    10.封藏
    封藏的目的是使制成的切片能夠永久保存,封藏劑必須能與透明劑互溶,對染色無影響,折射率近似玻璃和具有粘性的物質,常用的封藏劑有加拿大樹膠和中性樹膠。
    封片的方法是:將載玻片從二甲苯中吸出后,吸去多余的二甲苯,在標本上的二甲苯尚未干透之前加一滴樹膠,仔細覆蓋上蓋玻片,避免產生氣泡,也不得拖動蓋玻片,以免將標本破壞。樹膠量視蓋玻片大小而定,勿使過多過少。
    貼上標簽,注明材料、染色法,待封藏劑凝固后便成為一張成功的石蠟切片。

     


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